一、方法原理    

樣品經高氯酸提取，固相萃取、純化、濃縮，微孔濾膜過濾后，直接進樣。用反相色譜分離，紫外檢測器檢測，外標法定量。出峰順序為土霉素、四環素、金霉素。

二、主要儀器設備

1. 上海儀電分析高效液相色譜儀：具紫外檢測器。
2. 電子分析天平：感量為0.0001g。
3. 預處理柱：ODS-C18
4. 均質器。
5. 離心機：4000r/min
6. 負壓抽濾器。

三、試劑

1. 乙腈：色譜級
2. 磷酸二氫鈉溶液：0.01mol/L，pH=2.5
3. 土霉素、四環素、金霉素標準儲備液：土霉素、四環素1mg/mL，金霉素1mg/mL，甲醇為溶劑
4. 土霉素、四環素、金霉素混合標準使用液：土霉素、四環素0.05～1μg/mL，金霉素0.2～2μg/mL，流動相為溶劑
5. 高氯酸溶液：1%和0.5%
6. 甲醇：分析純
7. 乙二胺四乙酸二鈉溶液：5%
8. 正己烷：分析純

四、操作步驟

1、樣品處理

魚去鱗、去皮沿背脊取肌肉；蝦去頭、去殼取可食肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分；樣品切為0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻。

稱取5g精確到0.001g樣品，置于50mL離心管中，加入1%高氯酸溶液10ml，用均質器均質30s，于振蕩器上振蕩提取3min，以4000r/min離心10min，取上層清夜于50mL試管中，向離心管中的殘渣再加入0.5%的高氯酸溶液5mL，重復操作一次，合并上清液。加入1mL正己烷，振蕩1min后離心，除去正己烷相，再加入1mL正己烷，重復操作一次。

用5mL甲醇、2mL5%乙二胺四乙酸二鈉溶液、5mL水活化ODS-C18柱。接著將上述水相清液上樣。用10mL蒸餾水洗去雜質，以5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃水浴中氮氣吹干，以甲醇定容至1mL，以0.45μm濾膜過濾。濾液備用。

2、色譜參考條件

2. 1.色譜柱：ODS-C18

2. 2.柱溫：37℃

2. 3.檢測器：紫外檢測器，檢測波長：350nm

2. 4.流動相：乙腈-磷酸二氫鈉溶液22:78

2. 5.流速：1mL/min

2. 6.進樣量：20μL

3、工作曲線

在上述工作條件下，分別吸取混合標準使用液各20μL進樣，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制工作曲線。色譜圖如下，出峰順序依次為土霉素、四環素和金霉素。

4、樣品測定

取樣品濾液20μL進樣，記錄峰面積，從工作曲線算得土霉素、四環素、金霉素的含量。

5、結果計算

   樣品中土霉素、四環素、金霉素的含量按下式進行計算：

X=c×V/m                

式中：

X——樣品中抗生素的含量，單位為毫克每千克mg/kg；

c——樣品溶液中抗生素含量，單位為微克每毫升μg/mL；

m——樣品的質量，單位為克g；

V——樣品溶液體積，單位為毫升mL；

計算結果保留兩位有效數字。

6、方法回收率

    本方法的回收率≥70%。

7、方法檢測限

本方法的檢測限：土霉素≤0.05mg/kg，四環素≤0.05mg/kg，金霉素≤0.1mg/kg。出峰順序依次為土霉素、四環素和金霉素。