高效液相色譜儀主要有分析型、制備型和專用型三類。一般由五個部分組成,分別是高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統。
一. 高壓輸液系統
由貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等組成。
1. 貯液器:貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純,貯液器材料要耐腐蝕,對溶劑呈惰性。貯液器應配有溶劑過濾器,以防止流動相中的顆粒進入泵內。溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成,空隙大小一般為2mm。
2. 脫氣裝置:脫氣的目的是為了防止流動相從高壓柱內流出時,釋放出氣泡進入檢測器而使噪聲劇增,甚至不能正常檢測。
3. 高壓輸液泵:高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要部件,是驅動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統的高壓源,其性能好壞直接影響分析結果的可靠性。
對高壓泵的基本要求是:
①流量穩定;②輸出壓力高,最高輸出壓力為50Mpa;③流量范圍寬,可在0.01~10ml/min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動小。
二. 進樣器
進樣器一般要求密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統的壓力和流量波動小,并便于實現自動化。
高壓進樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類很多,有六通閥、四通閥,雙路閥等。以六通進樣閥最為常用。
三.分離系統
色譜分離系統包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分,柱應具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長的要求。通常采用優質不銹鋼管制成。
色譜柱按內徑不同可分為常規柱、快速柱和微量柱三類。
常規分析柱柱長一般為10~25cm,內徑4 ~ 5mm,固定相顆粒直徑為 5 ~ 10 mm。為了保護分析柱不受污染,一般在分析柱前加一短柱,約數厘米長,稱為保護柱。
(微量分析柱內徑小于l mm,凝膠色譜往內徑3~12 mm,制備往內徑較大,可達25 mm以上。)
四. 檢測系統
檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉化為可供檢測的信號,常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學發光等。
1. 紫外可見吸收檢測器(ultraviolet-visibledetector,UVD)
紫外可見吸收檢測器(UVD)是HPLC中應用最廣泛的檢測器之一,幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。其特點是靈敏度較高,線性范圍寬,噪聲低,適用于梯度洗脫,對強吸收物質檢測限可達1ng,檢測后不破壞樣品,可用于制備,并能與任何檢測器串聯使用。紫外可見檢測器的工作原理與結構同一般分光光度計相似,實際上就是裝有流動地的紫外可見光度計。
(1)紫外吸收檢測器
紫外吸收檢測器常用氘燈作光源,氘燈則發射出紫外-可見區范圍的連續波長,并安裝一個光柵型單色器,其波長選擇范圍寬(190nm~800nm)。它有兩個流通池,一個作參比,一個作測量用,光源發出的紫外光照射到流通池上,若兩流通池都通過純的均勻溶劑,則它們在紫外波長下幾乎無吸收,光電管上接受到的輻射強度相等,無信號輸出。當組分進入測量池時,吸收一定的紫外光,使兩光電管接受到的輻射強度不等,這時有信號輸出,輸出信號大小與組分濃度有關。
局限:流動相的選擇受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶劑不能做 流動相,每種溶劑都有截止波長,當小于該截止波長的紫外光通過溶劑時,溶劑的透光率降至10%以下,因此,紫外吸收檢測器的工作波長不能小于溶劑的截止波長。
(2)光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector, PDAD)
也稱快速掃描紫外可見分光檢測器,是一種新型的光吸收式檢測器。它采用光電二極管陣列作為檢測元件,構成多通道并行工作,同時檢測由光柵分光,再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號,然后對二極管陣列快速掃描采集數據,得到吸收值(A)是保留時間(tR)和波長(l)函數的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜數據,從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長。