高效液相色譜儀HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現各種意想不到的問題，本文主要說明色譜雙峰可能的原因及處理方法。 

色譜雙峰可能的原因有四種。

1、色譜柱

如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題，柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。

如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。

當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。

2、溶劑極性及進樣量

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。

樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。

當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。

上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。

如果樣品溶劑與流動相不溶或互溶性不好，當樣品注入色譜分離體系中，會析出并接著再溶解的可能，這時相當于二次進樣，也非常容易產生雙峰。

3、樣品的特性及ph值

有些樣品由于其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失，如紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如農藥啶蟲瞇（吡蟲清）。

pH對峰形的影響在緩沖液流動相平衡過程中非常明顯，當連續進樣時，受pH的連續變化影響會經常遇到這種雙峰的情況。另外，在樣品分析時，流動相的pH盡量遠離被分析物的等電點，否則也容易引起雙峰的產生。在用離子對試劑分析時，選擇不好條件也會容易引起雙峰的產生。

4、參數 

    記錄的參數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如C－R3A數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。

    還有一種情況是，參比波長設置錯誤，例如設置分析波長254nm，參比波長400nm，這個對于大多數化合物可能沒影響。但是如果被測化合物，在400nm處也有強的紫外吸收，比254nm更高。這樣其出峰時，由于背景的抵扣作用，本來一個峰會變成對稱的二個峰，而且如果將二峰之間的峰谷反轉180度，恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設置更大，或者取消。