色譜儀柱效下降的表現(xiàn)一般是峰變寬和峰高下降，有的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)分叉峰。造成柱效下降的原因很多，很多時(shí)候我們會(huì)想到柱子的問(wèn)題，其實(shí)溶劑與流動(dòng)相的不匹配會(huì)造成柱效下降。本文主要說(shuō)明溶劑造成柱效下降和峰分叉的原因。
一、實(shí)驗(yàn)
儀器：高效液相色譜儀配自動(dòng)進(jìn)樣器，UV/vis檢測(cè)器；C18色譜柱，4.6×250mm，5μm。
試劑：分析物F（易溶于甲醇和冰醋酸，微溶于乙醇和水，進(jìn)樣用80%的甲醇溶解），磷酸二氫鈉（分析純），乙睛（色譜純），甲醇（分析純）。
檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，緩沖溶液0.01M磷酸二氫鈉緩沖溶液；流動(dòng)相：乙腈：緩沖鹽=15:85。進(jìn)樣體積：100μl。
如圖1，在緩沖溶液pH =5.0時(shí)出現(xiàn)分叉峰（圖1），樣品F濃度為2μg/ml。下調(diào)緩沖鹽pH =3.0，仍然出現(xiàn)分叉峰（圖2）。
圖1. pH=5.0色譜圖
圖2. pH=3.0色譜圖
同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)所有的雜質(zhì)峰也都出現(xiàn)了分叉情況（圖3）。
圖3. 雜質(zhì)峰也出現(xiàn)分叉
二、原因分析
是什么原因造成了這種現(xiàn)象呢？
首先想到的是大體積進(jìn)樣造成的（因?yàn)檫M(jìn)樣20μl不能檢測(cè)到所分析物質(zhì)F濃度）進(jìn)樣100μl一般會(huì)造成峰擴(kuò)展，柱效下降，如果降低進(jìn)樣量還會(huì)出現(xiàn)分叉峰嗎？實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。進(jìn)樣體積減小，峰分叉的情況逐漸改善，在進(jìn)樣50μl的情況下，形成了肩峰（圖4小圖），進(jìn)樣40μl肩峰消失。
圖4 依次進(jìn)樣20,40,50,80,100μl的色譜圖。小圖為50μl進(jìn)樣后積分，該圖顯示色譜峰有肩峰
一般來(lái)說(shuō)，加大進(jìn)樣體積，峰會(huì)展寬很多，分離度降低，柱效下降（極端情況下如果是微柱或者UPLC會(huì)看不到峰），不會(huì)出現(xiàn)峰分叉，分叉峰是怎么形成的呢？更奇怪的是進(jìn)樣體積越大，出峰時(shí)間越靠前，在進(jìn)樣100μl和進(jìn)樣20μl的情況下，出峰時(shí)間相差4分鐘，為什么進(jìn)樣體積會(huì)影響出峰時(shí)間？
造成這些現(xiàn)象的原因只有一個(gè)：溶解分析物F的溶劑，增加進(jìn)樣體積只是放大了溶劑影響。在我們的實(shí)驗(yàn)中，溶劑采用80%的甲醇溶解，而流動(dòng)相是15%的乙腈，在反相色譜中，80%的甲醇洗脫能力強(qiáng)于15%的乙腈，就是說(shuō)溶解F的溶劑極性小于流動(dòng)相的極性。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜后，一部分分析物質(zhì)會(huì)和固定相結(jié)合，一部分還沒(méi)有和固定相結(jié)合就被洗脫能力強(qiáng)的溶劑帶著沿流動(dòng)方向移動(dòng)（色譜柱縱軸），這樣分析物就發(fā)生了擴(kuò)散（圖5擴(kuò)散），當(dāng)進(jìn)樣體積加大，進(jìn)入色譜系統(tǒng)的溶劑會(huì)改變色譜柱的流動(dòng)相組成，甚至?xí)斕娴袅鲃?dòng)相（圖5溶劑替代），在溶劑的洗脫下，出峰時(shí)間就會(huì)提早，溶劑里的分析物F和在色譜過(guò)程開(kāi)始的與固定相結(jié)合的分析物F會(huì)先后流出，這樣就形成了分叉峰（圖5檢測(cè)）。
圖5.溶劑造成的峰擴(kuò)散和峰分叉過(guò)程。橘黃色為溶劑，黑色為分析化合物，淡藍(lán)色為色譜
三、結(jié)論
1. 溶解分析物的溶劑最好使用流動(dòng)相或者洗脫能力比流動(dòng)相小的溶劑，避免峰展開(kāi)。
2. 考慮到分析物溶解性，如果選用洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)的溶劑，盡量減小進(jìn)樣體積，避免對(duì)色譜造成大的擾動(dòng)。
3. 如果目標(biāo)是能檢測(cè)2μg/ml的濃度，而現(xiàn)有分析方法的定量限LOQ是10μg/ml，請(qǐng)慎重使用加大進(jìn)樣量的改進(jìn)方法，加大進(jìn)樣量會(huì)產(chǎn)生很多意想不到的問(wèn)題，結(jié)果通常是進(jìn)樣量加大5倍，LOQ一般不會(huì)提高5倍。
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