梯度優(yōu)化是液相色譜方法開(kāi)發(fā)中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，有時(shí)一個(gè)合適的梯度洗脫程序?qū)σ合嗌V分析分離起到四兩撥千斤的作用。
一、建立梯度方法的原因
為什么要用梯度的方式來(lái)洗脫呢？混合樣品組分中，必定存在容易分離和不易分離的組分，保留較弱和保留較強(qiáng)的組分。我們建立梯度洗脫程序的目的就在于，將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動(dòng)相中實(shí)現(xiàn)盡快分離，而保留較強(qiáng)的組分在色譜柱內(nèi)停留較長(zhǎng)時(shí)間，與鍵合相表面發(fā)生充分的相互作用，盡可能地彼此拉開(kāi)，最后用強(qiáng)洗脫能力的流動(dòng)相洗脫出來(lái)，避免洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
二、反相液相色譜體系流動(dòng)相的洗脫能力
反相色譜中如何判斷流動(dòng)相的洗脫能力呢？在反相體系中，隨著流動(dòng)相的極性不斷增加（水相的比例在不斷增加），流動(dòng)相整體的洗脫能力逐漸減弱，而保留時(shí)間則在逐漸延長(zhǎng)。因此對(duì)于容易分離的組分，可嘗試在流動(dòng)相極性較大的環(huán)境下將其實(shí)現(xiàn)分離。
同時(shí)，為了提高整個(gè)樣品混合組分的分離度，在整個(gè)梯度程序內(nèi)，也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此進(jìn)行一個(gè)全新項(xiàng)目的反相條件方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候，最常用的初始梯度模式便是在0~40min內(nèi)，進(jìn)行一個(gè)95%水相有機(jī)相的線性洗脫。
三、反相液相色譜梯度優(yōu)化中心思路
反相色譜梯度優(yōu)化的中心思路，其實(shí)就是盡可能減弱流動(dòng)相的洗脫能力，從而減少共洗脫的情況。減弱流動(dòng)相洗脫能力最有效的方式是更換洗脫強(qiáng)度弱一些的溶劑，或者增減流動(dòng)相中的添加劑。
然而很多情況下是參照既定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溶劑種類和添加劑的量不便進(jìn)行過(guò)多的調(diào)整，這樣的情況下，還有一個(gè)方法可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，那就是減緩流動(dòng)相的變化斜率。
在進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)梯度優(yōu)化的時(shí)候，一定要注意兼容性的問(wèn)題，包括流動(dòng)相溶劑彼此之間的兼容性，以及流動(dòng)相和樣品的兼容性。流動(dòng)相溶劑選擇上，選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動(dòng)相溶劑不方便更換，則需盡量減緩流動(dòng)相的變化速率，給有機(jī)相和水相（鹽相）更多的時(shí)間來(lái)互溶。對(duì)于樣品來(lái)說(shuō)，流動(dòng)相的性質(zhì)一定要注意與樣品溶劑能夠兼容，避免出現(xiàn)在進(jìn)樣后的任意時(shí)刻樣品不溶解、析出的情況。
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