一、應(yīng)用背景

甲基硫菌靈(又名甲基托布津)是一種廣范譜內(nèi)吸型殺菌劑,被廣泛用于防治果品的輪紋病和黑腐病及貯藏期的青霉病和綠霉病等。但因生產(chǎn)商和銷(xiāo)售環(huán)節(jié)的違規(guī)操作,使果品中甲基硫菌靈的含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14870-94)規(guī)定（最高留限量每千克不超過(guò)0·5mg）。

為防止高殘留農(nóng)藥的果品及加工品上市,國(guó)家要求銷(xiāo)售前按國(guó)標(biāo)SN0162-92用氣相色譜—質(zhì)譜儀法,測(cè)定甲基硫菌靈的含量。但該方法儀器昂貴,操作技術(shù)復(fù)雜。為此介紹一種簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確可靠、一般實(shí)驗(yàn)室即可測(cè)試的紫外分光光度計(jì)測(cè)定法。

二、應(yīng)用儀器

紫外分光光度計(jì)，電子分析天平，離心機(jī)，燒杯，吸管，容量瓶，吸水紙，ph試紙

三、應(yīng)用試劑及配制

精確稱取50mg甲基硫菌靈可濕性粉劑,放入燒杯中,用三氯甲烷溶解,定容至50ml。從中準(zhǔn)確吸取10·00ml甲基硫菌靈的標(biāo)準(zhǔn)液,移入100ml容量瓶中,用三氯甲烷稀釋至刻度,制成甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)使用液。同樣精確稱取50mg多菌靈放入50ml容量瓶中,用1mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度。再準(zhǔn)確吸取10·00ml多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,移入100ml容器瓶中,用1mol/L鹽酸溶液定容至刻度,制成多菌靈標(biāo)準(zhǔn)使用液。

四、待測(cè)樣品的提取和分離

隨機(jī)抽取果實(shí)樣品,用清水洗去泥沙,晾干或用吸水紙吸干果實(shí)表面的水。將果實(shí)縱切分成兩等份,取果肉部分,置于干燥的組織搗碎機(jī)或研缽內(nèi)破碎磨細(xì)。稱取50g果泥樣品,加50ml甲醇,用高速離心機(jī)(每分鐘6000轉(zhuǎn))離心分離10分鐘,移上清液于燒杯中。沉淀物用20ml甲醇攪勻后,加水10m,l作用10分鐘,再次高速離心10分鐘。上清液并入盛濾液的燒杯中,在80℃水浴上用熱空氣流吹去部分甲醇,倒入分液漏斗中,加10%的氯化鈉溶液30ml和25ml石油醚,混合搖動(dòng)2分鐘后,再加25ml石油醚振搖2分鐘以充分提取待測(cè)物藥液。除去石油醚,加鹽酸提高酸度至pH值1~2,用二氯甲烷提取兩次(每次加25m,l作用2分鐘)。合并兩次的提取液,用25ml蒸餾水洗滌1次,用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層,移入干燥的分液漏斗中,供甲基硫菌靈含量測(cè)定之用。水洗液合并入水層,留作多菌靈測(cè)定用。

五、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0、10、30、50μg甲基硫菌靈),分別置于30ml圓底離心器中,離心揮干溶劑后,各加入10ml乙酸-乙酸銅溶液及2~5粒玻璃珠,接上空氣冷凝器,于酒精燈或微型電爐上緩緩加熱煮沸30分鐘取下,用20ml濃度為1mol/L的鹽酸洗滌冷凝管和圓底離心管,作用2分鐘。將液體移入125ml分液漏斗中。用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層移入備用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氫氧化鈉中和,調(diào)整pH值至6·0~6·5(堿液用量為25ml),中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把兩次的提取液合并在一起,再用10ml蒸餾水洗滌分液漏斗,靜置分層后,將二氯甲烷層并入另一存有二氯甲烷層的分液漏斗中。準(zhǔn)確加入10ml濃度為1mol/L鹽酸,再次提取5分鐘,靜置10分鐘左右。待分層后,將酸提取液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的零點(diǎn),在波長(zhǎng)282nm處分別測(cè)0~50μg甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度(A282)。以A282值為縱坐標(biāo),甲基硫菌靈的含量為橫坐標(biāo),繪制甲基硫菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml多菌靈標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0、10、30、50μg多菌靈),放入分液漏斗各加入20ml濃度為1mol/L的鹽酸,用二氯甲烷提取2次,每次用10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層,移入干燥的分液漏斗中。酸液用2mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸餾水洗滌1次。靜置分層后,將兩次的二氯甲烷層合并,準(zhǔn)確加入10ml濃度為1mol/L的鹽酸,再次酸提5分鐘。靜置10分鐘。待分層后,將酸提液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的零點(diǎn)。在波長(zhǎng)282nm處分別測(cè)0~50μg多菌靈標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值(A282)。以A282值為縱坐標(biāo),多菌靈的含量為橫坐標(biāo),繪制多菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

六、測(cè)定果品中的甲基硫菌靈和多菌靈含量

    取果肉的二氯甲烷提取液,自然揮干或加熱揮干后,用10ml乙酸-乙酸銅溶液分次溶解殘?jiān)?并移入30ml圓底離心器中,加2~5粒玻璃珠,接上空氣冷凝管,用酒精燈或微型電爐緩緩煮沸30分鐘取下,用20ml濃度為1mol/L的鹽酸從冷凝管頂端洗滌冷凝管和圓底離心管,作用2分鐘。將液體移入125ml分液漏斗中,用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷層移入備用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氫氧化鈉中和,調(diào)整pH值6·0~6·5(堿液用量為25ml)。中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把兩次的提取液合并在一起,再用10ml蒸餾水洗滌分液漏斗,靜置分層后,將二氯甲烷層并入另一種存有二氯甲烷層的分液漏斗中,準(zhǔn)確加入10ml濃度為1mol/L的鹽酸,再次提取5分鐘,靜置10分鐘左右。待分層后,將酸提取液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn)。在波長(zhǎng)282nm處測(cè)樣品的吸光度。與甲基硫菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,計(jì)算樣品中甲基硫菌靈的含量。取“待測(cè)樣品的提取和分離”中的多菌靈測(cè)定液,用2mol/L氫氧化銨溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸餾水洗滌1次,靜置分層后,將兩次的二氯甲烷層合并,準(zhǔn)確加入10ml濃度為1mol/L鹽酸,再次酸提5分鐘。靜置10分鐘,待分層后,將酸提液倒入1cm石英雙色杯中,用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn)。在波長(zhǎng)282nm處測(cè)定樣品的吸光度。與多菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,計(jì)算樣品中多菌靈的含量。

    測(cè)定結(jié)果按下式計(jì)算:X=V1×Cm×V2×100，式中V1為加入提取溶劑的總毫升數(shù);m為樣品重量(g);V2為測(cè)定時(shí)使用提取溶劑的毫升數(shù);C為相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)濃度(mg);X為樣品中甲基硫菌靈的含量(mg/kg)。

(注意:用石油醚和二氯甲烷萃取的整個(gè)過(guò)程,不論加入量還是取出量,必須準(zhǔn)確、快速。當(dāng)甲基硫菌靈殘留量過(guò)高時(shí),可減少樣品的用量或增加稀釋倍數(shù)。)